LABORATÓRIUM PRE VÝSKUM FUNKČNEJ MORFOLÓGIE PARAZITOV
(V. Hanzelová, M.Špakulová)
Laboratórium pre výskum štruktúry a funkcie parazitov vzniklo ako jedno z prvých laboratórií v roku 1953 a doteraz zastrešuje taxonomický výskum na ústave. Výskum je prioritne zameraný na štúdium makro- a mikroštruktúry, funkcie buniek, bunkových organel, tkanív, orgánov a orgánových sústav cudzopasníkov ľudí, zvierat a rastlín s ďalším využitím získaných poznatkov v komparatívnej morfológii, cytogenetike, taxonómii a evolúcii živočíchov. Dlhodobými cieľmi laboratória sú monitoring a ochrana biodiverzity, objavy a opisy pre vedu nových taxónov, ich redeskripcie a revízie systematickej klasifikácie vybraných skupín jednobunkových parazitov (Protista), motolíc (Trematoda), motolicovcov (Monogenea), pásomníc (Platyhelminthes), háčikohlavcov (Acanthocephala) a hlístovcov (Nematoda).
V súčasnosti sa ťažisko činnosti tradičného morfologicko-taxonomického laboratória cielene presúva do nových vedných oblastí. Zavádzaním nových prístupov bioinformatiky, molekulárnej cytogenetiky a úzkou spoluprácou s laboratóriom molekulárnej biológie laboratórium získalo interdisciplinárny charakter umožňujúci presnejšie, efektívnejšie a kvalitnejšie štúdium biologickej diverzity, parazito-hostiteľských interakcií a historického vývoja parazitov. Laboratórium bolo doplnené skenovacím elektrónovým mikroskopom JEOL JSM-6510LA (Obr. 1), modernejšími optickými prístrojmi svetelnej a fluorescenčnej mikroskopie LEICA DM4000 B (Obr. 2), doplnenými digitálnymi dokumentačnými zariadeniami a počítačovým software, ako sú analýza obrazu, programy umožňujúce rekonštrukcie historického vývoja organizmov (fylogenetických vzťahov parazitov a ich koevolúcie s hostiteľmi) ako aj systematickej klasifikácie taxónov.
Výskumné smery:
1) Taxonómia a systematika. Výskum mikroštruktúry a makroštruktúry parazitických organizmov na bunkovej a orgánovej úrovni, smerujúce k spresneniu identifikácií a systematického zatriedenia parazitov. Výskum zahŕňa štúdie morfologických a funkčných adaptácií parazitov, reprodukčných stratégií a dynamiky výskytu epidemiologicky a epizootologicky významných pôvodcov parazitóz ľudí, zvierat a rastlín a novo sa objavujúcich parazitárnych patogénov;
2) Cytogenetika a biochémia. S globálnymi klimatickými zmenami a negatívnymi antropogénnymi zásahmi do prostredia je úzko spojený výskum vplyvu znečistenia na vznik anatomických malformácií orgánov a orgánových systémov a na bunkovej úrovni na výskyt chromozómových aberácií, (submikroskopická prestavbu chromozómov) a na výskyt nadpočetných tzv. marker-chromozómov. Znečistenie prostredia a akumulácia polutantov v tkanivách živých organizmov bude zisťovaná spektrofotometricky. Testované budú možnosti potenciálneho využitia cytogenetických nálezov v karyosystematike;
3) Bioinformatika. Tento smer zahŕňa monitoring a ochranu parazitárnej zložky biodiverzity doposiaľ nepreskúmaných zoogeografických oblastí a medzinárodne významných ekosystémov, s využitím výsledkov v bioinformatike a tvorbe globálnych elektronických databáz parazitických druhov v európskom i celosvetovom meradle ako sú Fauna Europaea (http://www.faunaeur.org) a Global Cestode Database (http://www.tapeworms.org).
Laboratórium funkčnej morfológie parazitov je tesne previazané s laboratóriom pre molekulárnu biológiu ústavu a formou bilaterálnych a multilaterálnych spoluprác s partnerskými pracoviskami a prírodovednými múzeami v Anglicku, Českej republike, Francúzsku, Nemecku, Rusku, Španielsku a USA.
Infraštruktúra laboratória:
- Skenovací elektrónový mikroskop JEOL JSM-6510LA
- Fluorescencenčný mikroskop Leica DM 4000
- Atómový absorpčný spektrometer ZEENIT 700P
- Vysoko špecializovaný svetelný mikroskop NIKON 90i
- Svetelný mikroskop s fázovým kontrastom Leica DM5000
- Stereomikroskop s fotozariadením NIKON SMZ1000
- Mikrotóm Leica Ultracut EM UC7
- Parafínová stanica EM TP
- Termostat
Chladiaca odstredivka- Analytické váhy
- Váhový stôl
- Vodný kúpeľ s trepúcou vložkou
- Trepačka s kruhovým pohybom a inkubačným nástavcom
- Prístroj na úpravu vody pre biologické analýzy Purelab Classic UVF
- Vysokovýkonný PC
- Laboratórne stoly pod mikroskopy
- Kovová skriňa na horľaviny
LABABORATÓRIUM PRE MOLEKULOVÚ BIOLÓGIU
(I. Hromadová, B. Víchová, G.Hrčková, I.Papajová)
Molekulárny výskum v parazitológii je v súčasnej dobe zameraný na molekulárnu diagnostiku pôvodcov parazitóz, prevažne so zoonóznym charakterom. Cieľom výskumu je genetická charakterizácia pôvodcov, zistenie vnútrodruhovej a medzidruhovej variability parazitov človeka, hospodárskych a voľne žijúcich zvierat a rastlín. Laboratórium vyvíjalo aktivity vo výskume epidemiológie, molekulárnej diagnostiky pôvodcov, imunitných prejavov u hostiteľa, na diagnostiku a ochranu ľudí.
Na pracovisku je výskum molekulárnej biológie rozčlenený do viacerých oddelení
A - Oddelenie parazitozoonóz
B - Oddelenie prírodne ohniskových nákaz
C - Oddelenie ekologickej parazitológie.
Výskum v systematike helmintov je v súčasnosti zameraný na molekulárne štúdium rybích pásomníc radu Pseudophyllidea, pásomnice Echinococcus granulus a E. multilocularis a helminty raticovej zveri.
Výskum prírodne ohniskových nákaz je orientovaný na výskum genomiky pôvodcov prenosných chorôb pre zdokonalenie metód priamej identifikácie pôvodcov nových alebo novo sa vyskytujúcich kliešťami prenášaných nákaz ľudí a zvierat a na výskum molekulárnej patogenézy pôvodcov lymskej boreliózy, anaplazmózy-ehrlichiózy a babeziózy a expresie povrchových antigénov zodpovedných za patogenitu a ich virulenciu.
Pre poznanie rizika nakazenia ľudí toxoplazmózou bola zavedená PCR a RFLP metóda, ktorá je využívaná na zisťovanie prítomnosti parazita a jeho genetickú charakterizáciu v plodovej vode tehotných žien.
Výsledky sú podkladom pre detailnejšie poznanie biologických vlastnosti a špecifík modelových patogénov, ich adaptácie na hostiteľov resp. prenášačov a prostredie, ich prežívanie a dynamika výskytu. Umožňujú špecifikovať geografické rozšírenie jednotlivých genetických variantov na našom území aj v širšom geografickom kontexte v spolupráci s európskymi pracoviskami. Metódy molekulárnej epidemiológie sú využité pre zistenie dynamiky výskytu parazitov s následným identifikovaním rizikových oblastí ich výskytu.
Aplikovaním populačno-genetických prístupov (vyhodnotenie fixačných indexov populácií, miery génového toku, heterozygotnosti a inbrídingu) sa u echinokokov a trichinel stanovuje reprodukčný potenciál populácií, pravdepodobnosť šírenia génov rezistentných voči antihelmintikám a mikroevolučné procesy prebiehajúce v rámci druhov a kmeňov parazitov.
Skúmajú sa spôsoby špeciácie kmeňov a línií parazitov rodov Echinococcus, Trichinella, Dirofilaria, Toxoplasma, Borrelia a i. v rámci vnútrodruhovej genetickej štrukturalizácie a charakterizuje sa selekčný tlak prostredia, vedúci k vzniku nových genetických foriem. Pri sympatrickom výskyte genotypov a druhov sa sleduje prípadné premiešavanie génov, podmieňujúce vznik nových línií parazitov (často s rozdielnou infekčnosťou).
U vybraných medicínsky významných parazitov bude charakterizovaná molekulárna štruktúra kódujúcich génov, úroveň expresie génov a pripravia sa rekombinantné proteíny. Sú študované funkcie vybraných proteínov a peptidov v rámci hostiteľsko-parazitických interakcií a patogenézy pre hostiteľov.
Infraštruktúra laboratória:
- Real-Time PCR + HRM systém CFX96,
- Termocykléry MyCycler
Termocykler gradientový- Hlbokomraziaci box CVF 525/86
- Laminárne boxy Bioultra 4
- Chladiaca centrifúga
- Centrifúga
- CO2 inkubátor CB150
- Parný sterilizátor
- Dokumentačný systém DNR LumiBIS
- Spektrofotometer SPECORD S 600
- Vodný kúpeľ trepací
- Digitálny pH meter
- Analytické váhy
- Termostat
- Elektropororátor PROTEAN IEF Cell
- Digestor
- Lyofilizátor PL 3000
- Svetelný mikroskop NIKON 80i
- Laboratórny nábytok (stoly, váhový stôl, stoly pod prístroje, kovová skriňa na toxické látky a horľaviny, skrinky, závesné skrinky, laboratórna armatúra, stolička, výlevka)
LABORATÓRIUM PRE VÝSKUM ANTIHELMINTICKEJ REZISTENCIE
(M. Várady)
Laboratórium bude rozvíjať nasledujúce výskumné smery:
1) Detekcia ivermektín rezistentných parazitov so zameraním na zvýšenie citlivosti in vitro metód (test larválneho vývoja; migračno-inhibičný test a test larválnej paralýzy). Doterajšie poznatky laboratória potvrdzujú, že pri inkubácii parazitov v rôznych derivátoch ivermektínu sa signifikantne zvýši citlivosť diagnostických testov, čím sa umožní nielen potvrdiť rezistenciu, ale aj určiť počiatočnú fázu nástupu rezistencie v terénnych podmienkach.
2) Zistenie rozšírenia rezistencie na ivermektínové antihelmintiká v chovoch oviec na Slovensku na základe dotazníkového prieskumu a zasielania vzoriek z jednotlivých chovov do laboratória, kde sa vybranými in vitro metódami stanoví citlivosť parazitov k makrocyklickým laktónom.
3) Zavedenie molekulárnych metód pri identifikácii mechanizmov rezistencie na antihelmintiká, ktorými sa dajú identifikovať gény kódujúce enzýmy, ktoré sa zúčastňujú transportných mechanizmov pri vzniku rezistencie.
Modelovými helmintami pre uvedený výskum budú nematódy Haemonchus contortus a Teladorsagia circumcinta, ktoré sú najčastejšími a patogénnymi parazitmi domácich i voľne žijúcich prežúvavcov. U týchto parazitov sa antihelmintická rezistencia (aj multirezistencia na viaceré skupiny antihelmintík) vyskytuje najčastejšie. Hostiteľmi budú mladé ovce (jahňatá), ktoré sú najvhodnejším druhom k týmto experimentom. Pre získanie rôznych vývojových štádií uvedených helmintov budú jahňatá experimentálne nakazené subklinickými dávkami infekčných štádií parazitov. V rámci výskumu budú používané štandardné koprologické metódy na diagnostiku propagačných štádií parazitov, in vitro metodiky na diagnostiku rezistencie na antihelmintiká ako aj molekulárne metódy (allele-specific PCR) na genotypovú detekciu rezistentných a citlivých izolátov.
Infraštruktúra laboratória:
- Mikroskop LEICA DM IL invertovaný s fluorescenciou
- Svetelný mikroskop DM2000
- Stereomikroskop s fotozariadením Leica S8APO
- Odstredivka Allegra X-22R
- Analytické váhy
- Inkubátor
- Laminárny box Bioultra 4
- Termocyklér gradientový
- Spektrofotometer
- Chladiaca centrifúga
- Vodný kúpeľ trepací
- Digitálny pH meter
- Termoblok
- Laboratórny nábytok (závesné skrinky, laboratórna stolička, spodná skrinka, pracovná doska, výlevka kameninová, laboratórna armatúra)
LABORATÓRIUM PRE VÝSKUM KLIEŠŤAMI PRENÁŠANÝCH NÁKAZ S INTERDISCIPLINÁRNYM PRÍSTUPOM
(B.Peťko, V. Majláthová, M.Stanko)
Laboratórium sa vytvorilo v rámci Oddelenia prírodne ohniskových nákaz v r. 1993. Výsledky oddelenia, najmä v oblasti genomiky a molekulárnej patogenézy priniesli významné, svetovo prioritné výsledky ocenené domácimi i medzinárodnými cenami pre mladých vedcov. Postupne sa výskum zameriaval aj na štúdium ekológie kliešťov, najmä ich priestorovej variabilite rozšírenia, šíreniu do nových oblastí pod vplyvom globálnych klimatických zmien. Zistil sa výrazný posun optima klimatických podmienok pre výskyt kliešťov na Slovensku o viac ako 400 výškových metrov s hornou hranicou ich výskytu nad 1200-1400 m n.m. Boli získané prvé výsledky o individuálnej predispozícii niektorých špecificky disponovaných jedincov k napadnutiu kliešťami. Boli získané prvé výsledky o potenciálnom vplyve magnetického poľa Zeme na infikovanosť kliešťov boréliami. Tieto výsledky významne rozšírili metodológiu výskumu aj na doposiaľ v parazitológii netradičné geofyzikálne metódy.
Pre výskum ekologickej parazitológie a geografického mapovania rozšírenia parazitov a ich biotopov v aktuálnych podmienkach klimatických zmien sa využíva geografický informačný systém (GIS) so základným program, ktorý zahŕňa širokú paletu nástrojov pre geoprocesing, modelovanie a geografickú analýzu v prostredí, ktoré podporuje všetky druhy interakcií s užívateľom, vrátane tvorby zložitých vývojových diagramov. Výskum je zameraný na nástroje priestorovej analýzy, databázové schémy, prenos údajov z a do databáz, publikovanie údajov v mnohých formátoch, tvorbu presných máp, tvorbu analytických modelov, vytvárať vektorové prekryvy a štatistické analýzy. GIS je používaný veľkým počtom odborníkov vo svete i na Slovensku, je neoddeliteľnou súčasťou štúdia ekologickej parazitológie a epidemiológie.
Inovatívnosťou pri výskume ekológie kliešťov je využitie magnetometrie v terénnych výskumoch ako aj termovízie pre zobrazenie tepelného vyžarovania prostredia s mozaikovitým výskytom kliešťov. Predpokladá sa meranie geomagnetického poľa a nízkofrekvenčných zložiek magnetických a elektrických polí vo vybraných lokalitách Slovenska v súvislosti s lokálnym charakterom výskytu kliešťov. Termovízne zobrazovanie sa využije na plošné merania teploty povrchu pôdy (hrabanky) v modelových lokalitách za konštantných podmienok a pri porovnávaní tepelného vyžarovania hostiteľov, včítane ľudí napadnutých kliešťami rôznej intenzity ako aj testovaných chemických látok v pote (vydychovanom vzduchu) osôb v experimentoch pre atraktivitu pre kliešte.
Laboratórium má nasledujúce vybavenie:
- Termovízna kamera FLIR B 365
- GPS
- Software ArcView10, Geostatistical Analysys, Publisher, Tracking Analyst
- Mikroskop terénny
- Stereomikroskopy
- Scanner
- Klimaboxy
- Olfaktometer
- Digitálny pH meter/ mV meter
- Analytické váhy
- Laboratórny nábytok (stoly, stoly pod prístroje, váhový stôl, )
LABORATÓRIA PRE VÝSKUM PARAZITICKÝCH DVOJKRÍDLOVCOV
(A.Kočišová)
Hmyz prenáša sedem z desiatich najdôležitejších prenosných ochorení človeka trópov a subtrópov, ktoré sú sledované Svetovou zdravotníckou organizáciou. V dôsledku klimatických zmien sa rad teplomilnejších druhov postupne posúva z pôvodných areálov do nových severnejších oblastí. Rozširovanie potencionálnych vektorov z pôvodných areálov však opvplyvňujú nie len klimatické zmeny, ale i rastúci objem výmeny tovaru, zvierat a tiež zvýšený turistický ruch. Napríklad v súvislosti s rastúcim obchodom s opotrebovanými pneumatikami došlo k zavlečeniu komára Aedes albopictus pôvodom z juhovýchodnej Ázie do Albánska, Talianska, Francúzska, Belgicka a Srbska aj inde. Preto je na mieste otázka, či sa malária nevráti do Európy ako endemická prenosná choroba. Ďalšími potencionálnymi vektormi sú kútovky (Phlebotomus spp.), vektory leishmaniózy psov i človeka. Výrazné premnoženie komárov Aedes vexans a Ochlerotatus sticticusmôže mať okrem primárneho významu (cicanie krvi zvierat a človeka) aj sekundárny význam zvýšeného výskytu počtu najmä vírusových ochorení (vírus Tahyňa, West Nile a pod.).
Neobvyklé teplé obdobie ostatných dvoch rokov sa prejavilo i vo fenológii muškovitých (Diptera: Simullidae), pôvodcov nepríjemnej dermatitídy, tzv. simuliózy. Klimatické zmeny, výkyvy teplôt a náhle premeny počasia podporujú názor o šírení teplomilných druhov hmyzu na naše územie a možnosti prenosu patogénov. Dvojkrídlovce ako vektory predstavujú veľkú hrozbu pri prenose infekčného agens (napr. vírus West Nile).
Okrem komárov, čoraz väčší význam pri prenose vírusov (Togaviridae, Flaviviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae, neklasifikované Arbovírusy) predstavujú pakomáriky (Ceratopogonidae), ktorých niektoré druhy sú v rámci Slovenska potencionálnymi vektormi vírusu katarálnej horúčky oviec (modrý jazyk), ktorá na Slovensku nebola študovaná a ani nie sú k dispozícii praktické a vedecké skúsenosti zo surveillance tejto nákazy, ako u jedinej krajiny v rámci Európskej únie. Pritom sa jedná o nebezpečnú nákazu u domácich a voľne žijúcich prežúvavcov. Je povinnosťou každého členského štátu EÚ vrátane Slovenska zabezpečiť surveillance katarálnej horúčky na území krajiny vo väzbe na európsku legislatívu a kódex OIE.
Vplyvom otepľovania sa na Slovensku objavila nová komármi prenášaná helmintozoonóza - dirofilarióza. V minulosti bola táto infekcia na našom území diagnostikovaná veľmi vzácne ako importovaná (v súvislosti s pricestovaním z endemickej oblasti). V ostatnom období sa však situácia výrazne zmenila a v roku 2005 bolo toto ochorenie prvýkrát diagnostikované na Slovensku. Závažná je skutočnosť, že v roku 2007 bola dirofilarióza na Slovensku diagnostikovaná v 2 prípadoch u ľudí. Entomologický prieskum výskytu jednotlivých druhov komárov ako potenciálnych vektorov dirofilárií predovšetkým na východnom Slovensku chýba, máme čiastkové výsledky zo záplavových oblastí rieky Torysa, Udava a Bačkov.
Dobudovanie infraštruktúry pracoviska partnera, ktorý bude uvedenú aktivitu v prospech navrhovaného centra zabezpečovať, umožní výskum zameraný na identifikovanie zmien entomofauny s dôrazom na diagnostiku hematofágnych dvojkrídlovcov - pakomárikov (Ceratopogonidae) a komárov (Culicidae) vo vzťahu k celkovým globalizačným zmenám, vykonávať surveillance potencionálnych vektorov transmisívnych infekcií z typických tropických endemických oblastí do vybraných lokalít východného Slovenska. Zdokonalia sa metodické postupy laboratórnej detekcie ektoparazitov podrobným morfologickým štúdiom s využitím metód PCR. Pripravia sa podklady pre spracovanie diagnostického kľúča veterinárne významných pakomárikov a komárov SR.
Infraštruktúra laboratória
- Stereomikroskop s kamerovým systémom, fázovým kontrastom a kresliacim ramenom NIKON SMZ 1500
- Merací mikroskop MITUTOYO
- Termohydrograf s multifunkčnou klíma-sondou
- Klimabox s programovacou jednotkou a trojfunkčnou sondou
- Malaiseho pasca typ Double
- Lapač hmyzu
Aplikačné centrum pre ochranu ľudí, zvierat a rastlín pred parazitmi
ITMS 26220220018
Projekt bol zameraný na vytvorenie aplikačného centra pre ochranu ľudí, zvierat a rastlín pred parazitmi a pozostáva z troch špecializovaných pracovísk zameraných na:
- diagnostiku a prevenciu ľudských tkaninových helmintóz,
- diagnostiku a prevenciu helmitozoonóz,
- pre diagnostiku a prevenciu parazitóz rastlín.
Výsledkom projektu je zavedenie a štandardizácia vysoko špecifických a senzitívnych diagnostických metód, z ktorých viaceré neposkytuje žiadne iné diagnostické pracovisko na Slovensku (molekulárne metódy na diagnostiku pôvodcov závažných zoonóz, ako sú Echinococcus spp. u ľudí, Dirofilaria spp., Angiostrongylus vasorum a filarióz u mäsožravcov, genotypizácia Trichinella spp., ako aj diagnostiku parazitických nematód rastlín. Tieto metódy umožňujú presnú a rýchlu diagnostiku pre potreby humánnych a veterinárnych lekárov, ktorá je základom pre správnu a účinnú terapiu. Vyšetrenie na prítomnosť parazitov rastlín je podmienkou pre použitie sadbového materiálu, alebo rizikových substrátov v poľnohospodárstve.
Dňa 18.12.2012 bolo Aplikačnému centru Parazitologického ústavu SAV udelené Osvedčenie o akreditácii č. S-327: Akreditácia pre laboratórium s fixným rozsahom pre výkon skúšok:
1.) sérologická diagnostika echinokokózy,
2.) diagnostika trichinelózy tráviacou metódou magnetického miešania.
Okrem vyššie uvedených akreditovaných metód pracovisko poskytuje široké spektrum neakreditovaných metodík (polymerázová reťazová reakcia, druhová diagnostika parazitov, koprologické, mikroskopické a sérologické vyšetrenia biologického materiálu zvierat aj ľudí na pôvodcov parazitozoonóz, izolácia a detekcia voľne žijúcich a parazitických nematód rastlín z pôdy a rastlín).
Názvy firiem a inštitúcií, ktoré využívajú výsledky projektu
- EFSA (Európsky úrad pre bezpečnosť potravín)
- Ministerstvo pôdohospodárstva SR
- Štátna veterinárna a potravinová správa SR
- Výskumná stanica a múzeum TANAPu pri Štátnych lesoch TANAPu
- Ministerstvo vnútra SR a Ministerstvo obrany SR
- Súkromní veterinárni lekári a kliniky
- Infekčné kliniky, chirurgické kliniky, praktickí lekári
- AGRO CS Slovakia a.s., Lučenec
Infraštruktúra
Špecializované pracovisko pre diagnostiku a prevenciu ľudských tkanivových helmintóz:
- mikroskop binokulárny
- centrifúga
- termostat
- analytické váhy
- Ph meter digitálny
- magnetická miešačka
- ELISA reader
- inkubátor
- mikroplatničková premývačka
- laminárny box
- chladničky, mrazničky
- nábytok do laboratórií a pracovní
- počítačové vybavenie.
Špecializované pracovisko pre diagnostiku a prevenciu helmintozoonóz:
- termostat
- laboratórne váhy
- chladiaca odstredivka
- vodný kúpeľ s trepúcou vložkou
- termocyklér gradientový
- PCR box
- elektroforéza
- magnetické miešadlo
- dokumentačný systém
- chladničky, nábytok a vybavenie laboratórií.
Špecializované pracovisko pre diagnostiku a prevenciu parazitóz rastlín:
- stereomikroskop s fotozariadením
- trinokulárny mikroskop
- stoly pod mikroskopy
- výrobník ľadu
- miešadlo magnetické
- chladničky
- nábytok do laboratórií a pracovní.
Zabezpečenie technického zázemia všetkých troch pracovísk:
- parný sterilizátor
- umývačka skla